Иммунный блоттинг на вич

Главная » ВИЧ » Иммунный блоттинг на вич

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

  • Полоска А - Положительный контроль
  • Полоска В - Слабоположительный контроль
  • Полоска С - Отрицательный контроль
  • Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Источник: https://www.eurolab.ua/aids/2878/2888/35439

Современные методы диагностики ВИЧ-инфекции

Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного СПИДом. В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.

В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.

Методики диагностики ВИЧ

В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:

  • ИФА тест- система (скрининговый анализ);
  • иммунный блоттинг (ИБ).

Также для диагностики могут применяться другие методики:

  • ПЦР;
  • экспресс-тесты.

Современные методы диагностики ВИЧ-инфекции


ИФА тест-системы

На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.

Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.

Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).

Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).

Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:

  • отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
  • ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
  • ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
  • положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.

Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?

Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:

  • множественная миелома;
  • алкогольный гепатит;
  • инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
  • состояние после диализа;
  • аутоиммунные заболевания;
  • на фоне беременности;
  • состояние после вакцинации.

При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.

В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.

Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).

Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.

Иммунный блоттинг

Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.

Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.

ИБ считается положительным если:

  • по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
  • по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.

В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.

При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.

При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:

  • начальных стадиях ВИЧ-инфицирования ;
  • туберкулезе;
  • онкологических заболеваниях;
  • беременности;
  • частых трансфузиях крови.

В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).

Полимеразная цепная реакция

Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.

Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.

ПЦР применяется в таких случаях:

  • для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
  • для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
  • для контроля концентрации ВИЧ в крови;
  • для исследования донорской крови.

Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.


Экспресс-методы

Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.

Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.

Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.

Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.

Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.

Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.

О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в этой статье.

К какому врачу обратиться

Чтобы обследоваться на ВИЧ-инфекцию, нужно посетить терапевта и взять у него направление на анализ. Кроме того, можно прийти непосредственно в Центр профилактики и борьбы со СПИДом и сдать анализы там анонимно. Направляет на это обследование и врач-инфекционист или венеролог при подозрении на ВИЧ-инфекцию.

Автор: Юлия Карпова

Источник: https://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-vich-infekcii/

Тест-системы четвёртого поколения для одновременного выявления антигенов ВИЧ и антител к ВИЧ (продолжение...)

Важно отметить, что экспресс-тесты несложны и могут применяться в развивающихся странах, где лаборатории почти всегда плохо оборудованы, их персонал недостаточно обучен, а в подаче электроэнергии случаются перебои. В одном из видов экспресс-тестов используется иммуноблоттинг (дот-блоттинг). Если проба содержит антитела к ВИЧ, то в конце анализа на твердой подложке появляется четко очерченная окрашенная точка. Большинство современных тест-систем включают внутренний контроль, который показывает, что анализ был проведен без ошибок. Таким контролем являются антитела против человеческих иммуноглобулинов. Эти антитела связываются с любыми антителами в пробе и, если все реагенты были добавлены правильно, дают еще одну окрашенную точку.

Некоторые экспресс-тесты позволяют дифференцировать антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (в таких тест-системах имеются 2 зоны для нанесения реагентов и в результате анализа окрашивается одна из двух возможных точек). Все экспресс-тесты, работающие по принципу иммуноблоттинга, методически одинаковы и включают покапельное добавление реагентов в следующей последовательности: буферный раствор, проба, промывочный буферный раствор, конъюгат, промывочный буферный раствор, хромогенный субстрат, стоп-реагент. В некоторых экспресс-тестах вместо конъюгата используют красящий реагент - комплекс белка А с золотом. Белок А специфически связывается с иммуноглобулинами в пробе, а золото дает черное окрашивание.

Таким образом удается сократить процедуру анализа на одну операцию. Очень удобны новейшие одношаговые экспресс-тесты на антитела к ВИЧ, работающие по принципу иммунохроматографии. Их основной компонент - узкая хроматографическая пластинка (пластиковая или бумажная). На кончик пластинки наносят пробу (цельную кровь, сыворотку или слюну). Проба диффундирует вдоль пластинки, в которую в определенной последовательности импрегнированы необходимые реагенты (вместо конъюгата часто используют комплекс белка А с золотом). Если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ, в определенной зоне пластинки образуется окрашенная полоска. В некоторых иммунохроматографических экспресс-тестах используется принцип сэндвича с двумя антигенами.

Иммунохроматографические экспресс-тесты дают результат менее чем через 10 минут (а некоторые даже через 2 минуты), не требуют поэтапного добавления многочисленных реагентов и включают внутренние контроли для оценки качества анализа. Некоторые экспресс-тесты можно хранить в широком интервале температур (от 15 до 30°C), а транспортировать их очень легко. Например, экспресс-тест Determine фирмы Abbott поставляется в виде блоков по 10 пластинок в каждом и, таким образом, пластинки для 100 анализов могут уместиться в кармане. В этом экспресс-тесте на пластинку наносится только сыворотка или плазма, а другие реагенты не нужны. Можно использовать и цельную венозную или капиллярную кровь, но тогда требуется предварительно нанести буферный раствор.

Иммунохроматографические экспресс-тесты на антитела к ВИЧ приобретают все большую популярность, поскольку они методически несложны, результаты их очевидны и для их выполнения не нужны квалифицированные лаборанты. Их можно применять на дому или в передвижных лабораториях. Для этого достаточно обучить любого медицинского работника взятию крови из пальца. Экспресс-анализ капиллярной крови на антитела к ВИЧ может использоваться на станциях переливания крови для обследования доноров перед кроводачей (вместо того, чтобы брать дозу крови и хранить ее до прихода результатов из центральной лаборатории).

Имеются иммунохроматографические экспресс-тесты, предназначенные для выявления антител к ВИЧ в любом биологическом материале (цельной крови из вены или из пальца, плазме, сыворотке, слюне). Это дает возможность использовать тот биологический материал, который доступен в конкретной ситуации. Другая разновидность экспресс-тестов - это погружные тест-полоски, на которых имеются зубцы, покрытые антигеном. Некоторые тест-полоски позволяют дифференцировать антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Недостатки таких тестов: субъективность интерпретации результата; невозможность оценки результата, если лаборант страдает дальтонизмом; более высокая стоимость, чем у ИФА. В настоящее время в США разрешено использовать 4 типа экспресс-тестов.

Простые тесты: Простые тесты на антитела к ВИЧ занимают более 30 минут, но не требуют лабораторного оборудования. Все простые тесты основаны на реакции агглютинации. Частицы, покрытые антигенами ВИЧ (эритроциты, частицы латекса или желатина) инкубируют с сывороткой. Если в сыворотке присутствуют антитела к ВИЧ, происходит агглютинация и образуются видимые конгломераты. Если используются эритроциты, методику называют пассивной гемагглютинацией, если используются частицы латекса - латекс-агглютинацией. В странах Дальнего Востока в простых тестах чаще всего используют частицы желатина. Такие тесты дешевы, несложны, достаточно чувствительны и включают внутренний контроль для выявления неспецифического связывания сывороточных иммуноглобулинов с желатином. Результаты получаются через 2 часа с минимальными трудозатратами. Обязательное условие для проведения простых тестов - это наличие термостата (реакция агглютинации должна проходить при определенной постоянной температуре).

Подтверждающие тесты: Для подтверждения положительного результата, полученного при скрининговом тестировании, необходимы высокоспецифичные методики: иммуноблоттинг, непрямая иммунофлюоресценция или радиоиммунопреципитация. При аккуратном выполнении подтверждающие тесты не должны давать ложноположительных результатов. Подтверждающие методы более дороги и трудоемки, чем скрининговые. В США подтверждающие тесты не должны в обязательном порядке сертифицироваться Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств. Исключение составляют подтверждающие тесты, которые применяются для проверки доноров крови с положительной реакцией при скрининговом тестировании (для повторного допуска к кроводаче результаты подтверждающего теста должны быть отрицательными). Главная задача подтверждающих тестов - это исключение диагноза ВИЧ-инфекции у лиц, не инфицированных ВИЧ, но давших положительную реакцию при скрининговом тестировании.

Источник: https://www.eurolab.ua/aids/2878/2888/35436/?page=2