Иммуноблотинг при вич

Главная » ВИЧ » Иммуноблотинг при вич

Тест-системы четвёртого поколения для одновременного выявления антигенов ВИЧ и антител к ВИЧ (продолжение...)

Иммуноблотинг: Иммуноблоттинг - самый распространенный подтверждающий тест для выявления антител к ретровирусам; большинство специалистов считают этот метод эталонным при подтверждении ВИЧ-инфекции. Метод основан на электрофоретическом разделении антигенов ВИЧ, полученных из лизата вирусов, выращенных в клеточной культуре. При электрофорезе вирусные белки денатурируются, приобретают отрицательный заряд и разделяются по молекулярной массе. Разделение вирусных антигенов позволяет выявлять специфические антитела к каждому из них в ходе последующего анализа, методологически сходного с ИФА. Смесь очищенных антигенов ВИЧ вносят в несколько лунок на краю пластины полиакриламидного геля, содержащего додецилсульфат натрия, после чего проводят электрофорез. При этом антигены ВИЧ из каждой лунки мигрируют вдоль пластины геля. Скорость миграции определяется зарядом и молекулярной массой антигенов (так, высокомолекулярные антигены проходят меньшее расстояние от точки старта). После завершения электрофореза гель накладывают на нитроцеллюлозную мембрану и переносят на нее разделившиеся антигены (эта процедура называется блоттингом и проводится путем электропереноса). Мембрану разрезают на полоски, на каждой из которых представлен полный набор антигенов ВИЧ. На полоски наносят тестируемую или контрольную сыворотку в разведении 1:50 или 1:100, инкубируют и отмывают. С этого момента методика сходна с любым непрямым иммунным анализом. Полоски инкубируют с мечеными антителами против человеческих иммуноглобулинов. В качестве метки обычно используют фермент (пероксидазу или щелочную фосфатазу), который катализирует превращение бесцветного хромогенного субстрата в окрашенный нерастворимый продукт. В результате на полоске образуются поперечные окрашенные полосы в тех местах, где образовались комплексы антиген-антитело. Положительные сыворотки дают набор полос, характерный для ВИЧ-инфекции. Многие из этих полос были идентифицированы как специфические продукты вирусных генов. Антигены ВИЧ-1 при электрофорезе распределяются следующим образом (начиная от точки старта): gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, p15. Буквой «p» обозначают белки, буквами «gp» - гликопротеиды. Цифрами обозначают молекулярную массу антигенов (в кДа). При анализе результатов иммуноблоттинга надо помнить, что в исходном лизате содержатся не только антигены ВИЧ, но и белки культивируемых клеток, в которых размножался вирус. Эти белки могут образовывать полосы в разных местах, чаще всего - в зоне между 40 и 60 кДа. Неспецифическое связывание антител из тестируемой пробы с клеточными белками может затруднить оценку результатов.

Интерпретация результатов: В зависимости от того, какие антитела к ВИЧ присутствуют в тестируемой пробе, на нитроцеллюлозных полосках видны разные наборы полос. По характеристике набора полос (их числу и интенсивности окрашивания) и судят о том, присутствуют ли в пробе антитела к ВИЧ. Результаты иммуноблоттинга оценивают по определенным критериям. Согласно этим критериям, проба считается положительной, если присутствуют по крайней мере две из трех полос, соответствующих антигенам p24, gp41 и gp120/160. Проба считается отрицательной только в том случае, когда нет ни одной из полос, соответствующих антигенам ВИЧ. Однако две организации, включая ВОЗ, придерживаются мнения, что пробу можно считать отрицательной, если имеется лишь одна очень слабо окрашенная полоса p17. Результат считается сомнительным, если имеется одна полоса или более, соответствующая антигенам ВИЧ, но критерии положительного результата не выполняются.

К сожалению, сыворотки некоторых людей, не инфицированных ВИЧ, при иммуноблоттинге в той или иной степени реагируют с одним или несколькими антигенами ВИЧ. Такая реакция бывает почти у 15% здоровых людей, не инфицированных ВИЧ; она нередко наблюдается у лиц с отрицательным результатом скринингового тестирования. Таким образом, многие сыворотки, давшие отрицательный результат при скрининговом тестировании методом ИФА, дадут сомнительный результат при иммуноблоттинге. В большинстве случаев при сомнительных результатах слабо окрашиваются полосы, соответствующие белкам полипротеина Gag (главным образом, p17, p24 и/или p55). Встречаются и другие наборы полос, но реже. Любой результат иммуноблоттинга, не удовлетворяющий критериям положительного или отрицательного результата, должен считаться сомнительным.

Источник: https://www.eurolab.ua/aids/2878/2888/35436/?page=3

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

В последние годы большой популярностью стал пользоваться метод обнаружения генного материала ВИЧ методами репликации (амплификации, размножения) специфических генных последовательностей, часто объединяемых под названием одного из вариантов этого метода «полимеразная цепная реакция» (ПЦР).

В основе метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК.

Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae. Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с фенотипом CD-4, присущий Т-лимфоцитам хелперам и некоторым другим клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трёх направлениях:

  1. серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга, заключающаяся в определении в сыворотки крови антигенов и антител против ВИЧ.
  2. определение вирусной НК (провирусной-ДНК или РНК) методом ПЦР, как в крови, так и в клетках крови.
  3. исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4 лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии.

Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить материнские и собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системой к возрасту 6-9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока.

Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного вскармливания ребёнка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, т.к. риск заражения довольно высок и составляет около 5%.

Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если имеет место отрицательный результат ПЦР в первые 48 часов, но становится положительным в возрасте 7 – 14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum.

В настоящее время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вируса иммунодефицита. Определение “вирусной нагрузки” в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности антиретровирусной терапии.

Известные модификации ПЦР для диагностики ВИЧ-инфекции достигают чувствительности лишь в 98%, то есть выявляют лишь 98% проб от ВИЧ инфицированных лиц, что существенно ниже, чем при использовании ИФА (до 99,9%). По этой причине они не могут использоваться и как подтверждающие тесты, так как будут давать заведомо больше ложноотрицательных результатов, чем иммуноблот. Методика ПЦР на практике ведет себя как чересчур «чувствительная» к внешним колебаниям, и в неумелых руках, и в недостаточно хорошо оборудованных лабораторных условиях дает немалое количество неспецифических (ложноположительных) реакций. Специфичность ПЦР также зависит от подбора используемых в ней ингредиентов, в особенности, так называемых «праймеров», которые должны имитировать «генные последовательности ВИЧ», но далеко не всегда могут быть точно подобраны. Неудачный подбор может приводить, в частности, к тому, что такие тесты могут с разным успехом выявлять разные субтипы ВИЧ-1, например, выявлять субтип B и не выявлять субтип A и G т.п. Впрочем, разработка этих методик идет быстрыми темпами и не исключено скорое появление более качественных наборов стандартных реактивов. На практике врачи должны учитывать операционные характеристики предлагаемых им диагностических тестов, изначально предполагая, что их полевая (практическая) ценность может быть существенно ниже заявляемой производителями.

Теоретическое преимущество ПЦР состоит в том, что она способна выявлять ВИЧ-инфекцию в инкубационном и раннем клиническом периоде, когда антител еще может не быть. Однако, она пока не всегда может выявлять инфицированных в более позднем периоде инфекции. Это в будущем, возможно, будет иметь значение и при попытке диагностики ВИЧ-инфекции у лиц, получающих противоретровирусную терапию, когда уровень ВИЧ в крови значительно снижается. Совместное использование двух методик, которое могло бы быть выходом из создавшейся ситуации - ИФА и ПЦР, к сожалению, сделает исследования значительно дороже, тем более, если они осуществляются в массовом масштабе.

Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах:

  1. Обнаружение ДНК провируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови;
  2. Обнаружение РНК ВИЧ в биологических жидкостях организма (например, в плазме или сыворотке крови).

Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

  1. В период серологического "окна". Хотя следует помнить! что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;
  2. В случае сомнительного результата ИБ;
  3. При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.

Источник: https://www.eurolab.ua/aids/2878/2888/35438

Современные методы диагностики ВИЧ-инфекции

Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного СПИДом. В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.

В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.

Методики диагностики ВИЧ

В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:

  • ИФА тест- система (скрининговый анализ);
  • иммунный блоттинг (ИБ).

Также для диагностики могут применяться другие методики:

  • ПЦР;
  • экспресс-тесты.

Современные методы диагностики ВИЧ-инфекции


ИФА тест-системы

На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.

Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.

Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).

Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).

Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:

  • отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
  • ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
  • ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
  • положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.

Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?

Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:

  • множественная миелома;
  • алкогольный гепатит;
  • инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
  • состояние после диализа;
  • аутоиммунные заболевания;
  • на фоне беременности;
  • состояние после вакцинации.

При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.

В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.

Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).

Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.

Иммунный блоттинг

Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.

Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.

ИБ считается положительным если:

  • по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
  • по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.

В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.

При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.

При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:

  • начальных стадиях ВИЧ-инфицирования ;
  • туберкулезе;
  • онкологических заболеваниях;
  • беременности;
  • частых трансфузиях крови.

В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).

Полимеразная цепная реакция

Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.

Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.

ПЦР применяется в таких случаях:

  • для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
  • для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
  • для контроля концентрации ВИЧ в крови;
  • для исследования донорской крови.

Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.


Экспресс-методы

Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.

Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.

Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.

Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.

Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.

Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.

О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в этой статье.

К какому врачу обратиться

Чтобы обследоваться на ВИЧ-инфекцию, нужно посетить терапевта и взять у него направление на анализ. Кроме того, можно прийти непосредственно в Центр профилактики и борьбы со СПИДом и сдать анализы там анонимно. Направляет на это обследование и врач-инфекционист или венеролог при подозрении на ВИЧ-инфекцию.

Автор: Юлия Карпова

Источник: https://myfamilydoctor.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-vich-infekcii/